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　　基因載體是基因工程的核心，也是基因治療中強(qiáng)有力的生物工具，我們先來認(rèn)識(shí)和閱讀載體圖譜吧。

　　載體分類及載體組成元件

　　載體分類

　　1、按屬性分類：病毒載體和非病毒載體

　　病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可將遺傳物質(zhì)帶入細(xì)胞，原理是利用病毒具有傳送其基因組進(jìn)入目的細(xì)胞，進(jìn)行感染的分子機(jī)制?？砂l(fā)生于完整活體或是細(xì)胞培養(yǎng)中?？蓱?yīng)用于基礎(chǔ)研究、基因療法或疫苗。用于基因治療和疫苗的病毒載體應(yīng)具備以下基本條件：

　　(1)攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒;

　　(2)介導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)移和表達(dá);

　　(3)對人體不致病;

　　(4)在環(huán)境中不會(huì)引起增殖和傳播。

　　非病毒載體一般是指質(zhì)粒DNA。

　　2、按進(jìn)入受體細(xì)胞的類型分類：原核載體、真核載體、穿梭載體(含原核和真核2個(gè)復(fù)制子，能在原核和真核細(xì)胞中復(fù)制，并可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá))。

　　3、按功能分類：克隆載體、表達(dá)載體

　　克隆載體：具有克隆載體的基本元件(Ori，Ampr，MCS等)，可以攜帶DNA或外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞并克隆和大量擴(kuò)增DNA(外源基因)的載體。

　　表達(dá)載體：克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控(具有轉(zhuǎn)錄/翻譯所必需的DNA順序)有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。

　　載體組成元件

　　1、復(fù)制起始位點(diǎn)Ori：即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。Ori的箭頭指復(fù)制方向，其他元件標(biāo)注的箭頭多指轉(zhuǎn)錄方向(正向)。

　　2、抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ，Kan+

　　(1)Ampr：水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

　　(2)tetr ：可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

　　(3)camr：生成氯霉素羥乙?；苌?，使之失去毒性。

　　(4)neor(kanr)：氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。

　　(5)hygr：使潮霉素β失活。

　　3、多克隆位點(diǎn)：MCS克隆攜帶外源基因片段，它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)，便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。還要再看外源DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10kb的外源DNA。一般來說，外源DNA越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

　　4、P/E：啟動(dòng)子/增強(qiáng)子

　　5、Terms：終止信號(hào)

　　6、加poly(A)信號(hào)：可以起到穩(wěn)定mRNA作用

　　示例閱讀載體：

　　1.pENTER載體

　　1)human ORF + pENTER載體

　　2) CMV啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子

　　3) ORF的C端融合了Flag和His tag

　　4) 多克隆位點(diǎn)，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常見的)

　　4) SV40 poly(A)加尾信號(hào)

　　5) SV40啟動(dòng)子啟動(dòng)的puro標(biāo)記

　　6) 2個(gè)腺病毒ITR序列和2個(gè)與腺病毒Ad5同源的序列，可用于將ORF序列同源重組到腺病毒載體，直接用于腺病毒的生產(chǎn)。

　　2.慢病毒載體

　　1)EF1a啟動(dòng)目的基因(可添加小標(biāo)簽FLAG或HIS等小標(biāo)簽)

　　2)CMV啟動(dòng)GFP，非融合抗性篩選標(biāo)記Puro(便于做細(xì)胞株的穩(wěn)篩)

　　3)WPRE(來自土撥鼠肝炎病毒的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件)，放置在目的基因的上游，能加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)

　　4) cPPT(來自HIV-1整合酶基因)，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數(shù)，提高病毒滴度

　　5)第三代慢病毒載體，載體中還包含HIV-1基因組中的順式調(diào)節(jié)元件(ψ 包裝 信號(hào)和LTR 長末端重復(fù)序列，其中3’LTR增強(qiáng)子功能缺失，5’LTR中U3區(qū)替代為CMV，更加安全的病毒載體)

　　3.腺相關(guān)病毒載體

　　AAV表達(dá)載體包括了中兩個(gè)ITR + CMV(可替換其他組織特異性啟動(dòng)子，見改造載體部分)+ globin intron 內(nèi)含子序列 + 目的基因 + poly A序列

　　選擇載體

　　選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)還要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)等。如果構(gòu)建的目的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。選用哪種載體，還是要結(jié)合目的基因及載體特點(diǎn)以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

　　載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：

　　1、構(gòu)建DNA重組體的目的，克隆擴(kuò)增/表達(dá)表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。

　　2、載體的類型：

　　(1)克隆載體的克隆能力—據(jù)克隆片段大小(大選大，小選小)。尤其對于病毒載體來說，載體包裝容量的大小是評估能否成功包裝病毒的首要因素。

　　①腺病毒可以插入長約8kb的外源基因。目前，我們包裝過長度為7.5kb外源基因的腺病毒。

　　②慢病毒的包裝容量約為6kb(包含載體帶有的其他抗性基因或報(bào)告基因)，但是2kb以上的外源基因包裝慢病毒難度就增加了，增大1kb會(huì)下降1個(gè)單位數(shù)量級的滴度，故2kb以上的基因包裝慢病毒需要進(jìn)行評估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白(作為受體、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白行使功能)等由于其本身的功能，包裝可能會(huì)有一定難度。

　?、跘AV的總包裝容量是4.7 kb(包含載體中兩個(gè)ITR約0.3kb +具體啟動(dòng)子 + 內(nèi)含子約0.6kb + 具體熒光標(biāo)簽 + polyA約0.2kb)，所以插入目的基因一般約2kb 左右。由于AAV包裝容量有限，目的基因大于2kb，可考慮去除內(nèi)含子，因?yàn)閮?nèi)含子只是有助于插入的目的基因穩(wěn)定表達(dá)。

　　(2)確定表達(dá)蛋白的目的，然后再來選擇優(yōu)勢的表達(dá)質(zhì)粒。一般分為原核表達(dá)和真核表達(dá)質(zhì)粒，前者主要用于體外純化蛋白，如帶His-tag的PET系列，帶GST-Tag的PGEX系列，選用不同的表達(dá)載體，就得建立相應(yīng)的純化系統(tǒng)，包括緩沖液的配置、珠子/柱子的選擇等等，還得考慮目的蛋白的可溶性，一般大tag的融合蛋白可溶性要好一些，如GST的。這種原核純化的蛋白一般用來制備單一的、需要量大的蛋白。真核表達(dá)載體一般是細(xì)胞、體內(nèi)表達(dá)等需要時(shí)所用，只需要將它放到細(xì)胞或體內(nèi)細(xì)胞即可，唯yi考慮的是它的啟動(dòng)子的選擇，常用都是cmv啟動(dòng)子的，表達(dá)效率較高，也有多種啟動(dòng)子經(jīng)過改造的表達(dá)載體，一般用來表達(dá)需要調(diào)控表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量的蛋白。

　　3、載體MCS中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于連接，不產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。

　?、龠x分子量小的質(zhì)粒，即小載體(1-1.5kb)→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);

　?、谝话闶褂盟沙谛唾|(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè);

　?、郾匦杈邆湟粋€(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地;

　?、鼙匦栌幸讬z測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因。

　　選擇載體還需注意：

　　無標(biāo)簽載體，起始/終止密碼子都要添加!

　　標(biāo)簽在N端的載體，終止密碼子要添加!

　　標(biāo)簽在C端的載體，起始密碼子要添加!